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在过去十年中许多研究详细阐述了血小板在止血和血栓形成之外的新功能。分子和功能研究表明血小板在血管重塑、免疫调节和组织再生过程中发挥及其重要的作用（图 1）。血小板在心血管疾病发展过程中的作用已被证实，血小板还被证明是癌症、炎症性疾病和感染（例如严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)）的病理生理过程中的关键参与者。对血小板及其异质状态、血小板释放物和其他靶细胞在各种疾病中的研究为诊断、预后和治疗能提供重要的机制线日，Hwa和他的团队在《Nature CardiovascularResearch》杂志上发表了一篇综述文章， “A guide to molecular and functional investigations of platelets to bridge basic and clinical sciences”。这篇综述讨论了血小板的病理生理作用以及基础和临床血小板检测的新方法的最新进展，希望在快速地发展的血小板科学和临床实践之间架起一座桥梁。
血小板是无核的、小的 (2–4 µm)、寿命短 (7–10 d) 的血液循环细胞，在血栓形成中具备极其重大作用。血小板释放物可以在机械应力、内皮损伤和胶原暴露后引发和促进血栓形成。循环血管性血友病因子与血小板糖蛋白结合以及血小板 GPVI-胶原蛋白相互作用有助于受损部位的初始血栓形成。在最初粘附到受损血管壁和血小板活化后，血栓素A2和ADP 介导血小板的募集。血小板纤维蛋白原受体αIIbβ3主要有助于血栓的形成和稳定。凝血因子和其他细胞（包括单核细胞、血管平滑肌细胞(VSMCs)、巨噬细胞和内皮细胞）的激活进一步促进了血栓的形成。
血小板含有异质的编码和非编码 RNA以应对各种刺激。血小板中 RNA 含量降低直接影响血小板寿命，血小板的反应性与miRNA的丰度有关。活化的血小板也可以释放 miRNA并可能导致血浆中 miRNA水平的增加。几种主要存在于细胞外囊泡中的血小板衍生的 miRNA 与心血管疾病有关。选定的miRNA已被证明在预测死亡率具有临床意义，并可能作为评估抗血小板方案疗效的生物标志物。
循环中的血小板可以以不同的状态存在，它们在大小、年龄和反应性方面的异质性可能反映在静止状态、激活状态以及疾病过程中。血小板体积增大，伴随血小板聚集性增加，与心血管和外周动脉疾病风险增加相关。未成熟的血小板可能更能抵抗阿司匹林和氯吡格雷的抑制作用。除了基于年龄的功能差异外，血小板的状态过度活跃或凋亡都会增强血栓形成的倾向。因此，了解和识别血小板的不同状态对研究疾病过程有重要意义。
血小板可以直接或间接通过血小板释放物（例如，生长因子、止血因子、miRNA）与其他细胞相互作用来发挥病理生理作用（图 1）。内皮损伤后VSMC 暴露于循环血小板中，血小板不仅释放生长因子刺激 VSMC去分化以促进伤口愈合，而且血小板本身也可以被 VSMC吸收。抑制血小板功能可减少内皮功能障碍并限制动脉粥样硬化和动脉粥样硬化血栓事件的进展。在 COVID-19 中也观察到血小板与内皮细胞的相互作用。活化的血小板还可以与单核细胞相互作用形成血小板-单核细胞聚集体，这些聚集体参与心血管和其他炎症性疾病。表 1 总结了血小板与其他细胞的相互作用。
检测血小板功能状态和细胞间相互作用有利于我们认识血小板在疾病发病机制中的作用。本文概述了一些实验室研究技术和目前使用的临床方法，供研究血小板异质性和血小板与其他细胞的相互作用。
它们的生理功能包括通过与血管壁的相互作用维持血管完整性，以及促进伤口愈合和血管生成。血小板还通过储存和释放许多必需的血浆因子（如生长因子（VEGF、TGF-β等）和血管张力调节因子（如血清素）来维持血浆内容物的稳态。血小板通过细胞因子的储存和释放以及与多种循环免疫细胞的相互作用，与生理性炎症反应密切相关。其中许多稳态功能是通过转移（如，mRNA或miRNA）到其他细胞或接受其他细胞来介导的。血小板在血栓性疾病中的病理作用得到了充分研究，如糖尿病和许多其他疾病过程中血管血栓形成的增强。血小板还与疾病状态的发病机制有关，如感染（脓毒症和病毒感染，包括COVID2019），恶性肿瘤，炎症性疾病、自身免疫性疾病、肝脏疾病和肾脏疾病。这种生理和病理方面的功能多样性对于一个没有细胞核的短命小细胞来说是不寻常的。用临床方法补充基础研究可以为这些不同的功能提供关键的机制性见解。
传统的血小板技术，如光透射聚集度测定法 (LTA) 仍在全球范围内用于了解血小板反应，下面回顾的新兴技术将更深入地评估血小板生物学和功能。每种方法都有优点和局限性（表 2），研究人员可根据特定研究目标选择最适合的测定方法。
血小板聚集测定法被认为是血小板功能分析的金标准。样品处理后几分钟即可进行聚集测量，并且可以对全血、富血小板的血浆或洗涤的血小板进行测量。多电极聚集测量法使用多个电极并且是高通量的，尽管可以在全血中进行多电极聚集测定，在血小板计数低的样本中不如传统的 LTA敏感。在基础研究中，血小板聚集测定法通常用于评估动物模型中基因缺失或过表达的影响或测试各种治疗剂的抗血小板活性。
流式细胞术是一种多样化且可靠的检测方法，可以定量检测活化的血小板及与其他细胞的相互作用。血小板聚集也可以使用流式细胞仪进行研究。流式细胞仪检测具有高灵敏度，可以在血小板计数低至 40,000个/mm3以下进行。许多血小板特异性标志物可以用于流式细胞术测定以研究血小板功能。血小板活化糖蛋白αIIbβ3 抗体 (PAC-1)可用于区分静息血小板和活化血小板。血小板表面CD62P（P-选择素），通常存在于血小板的α颗粒中，是血小板活化偶联脱颗粒的标志。使用钙结合荧光染料测量血小板内钙水平也可用于研究血小板活化动力学和活化状态。血小板线粒体去极化是线粒体功能、细胞凋亡和磷脂酰丝氨酸外化的重要参数，也可以通过流式细胞术检测。通过流式细胞术测量血小板内活性氧含量已用于血小板氧化应激的研究。使用噻唑橙（一种与核酸结合的荧光染料）进行流式细胞术可用于区分网状血小板亚群，在血小板减少性疾病中血小板生成和巨核细胞生成的估计中有及其重要的作用。临床上常使用自动血液分析仪（Sysmex XE-/XN 系列）测量全血中的未成熟血小板分数。目前已开发了流式细胞术在血小板功能分析中的智能应用，以识别健康供体中血小板对激动剂反应的异质性。
血小板含有大量蛋白质，包括膜蛋白、细胞骨架蛋白、信号蛋白、酶、凝血因子和转录因子。二维电泳质谱(2DE-MS) 蛋白质组学可以用于研究凝血酶诱导的血小板激活，鉴定血小板释放的特定蛋白质。磷酸化蛋白质组分析揭示了静息和活化血小板中的磷酸化模式。通过使用固定化金属亲和色谱 (IMAC) 、二氧化钛结合纳米液相色谱 (LC-MS) 和同位素标记定量蛋白组学 (iTRAQ)，可以识别血小板激活信号传导中的特定位点。糖基化蛋白质组研究显示，在与胶原蛋白结合后，粘附蛋白的N-连接糖基化具有主要作用。血小板蛋白泛素化是另一种重要的翻译后修饰，亦可以通过血小板泛素组进行分析。质谱流式细胞技术 (mass CyTOF) 是一种相当新颖的方法，它结合了流式细胞术和质谱法的特征，可以同时分析大量参数，已被用于识别以前未被重视的血小板亚群，成为一种强大的单细胞蛋白质组学技术。
多种脂质和脂肪酸，如磷脂、类固醇、甘油三酯、胆固醇酯等，以不同的比例存在于血小板中，可以调节血小板功能。目前，脂质组学通常使用“猎枪”脂质组学或 LC-MS进行。对血小板脂质组的综合分析表明，血小板脂质组在血小板活化过程中发生了改变，并且在血小板促凝功能中起作用。在低胆固醇血症中观察到的高胆固醇水平与血小板膜中胆固醇含量升高和血栓形成风险增加相关。因此，血小板脂质组学可能被用作分析疾病进程（例如动脉粥样硬化中的斑块进展），利于患者的风险分层和确定治疗效果。
尽管血小板缺乏细胞核，但基因组测序和/或全基因组关联研究可以通过研究与血小板表型特征、出血性疾病相关的基因突变或单核苷酸多态性来提供信息。使用微阵列和基因表达系列分析 (SAGE) 策略的血小板转录组学显示，血小板代表了基因库中约15-25%的人类基因。这些基因组分析对于遗传性血小板疾病和心血管疾病尤其重要。220 多名癌症患者循环血小板的RNA 测序和血小板 RNA 谱分析揭示了一种独特的血小板转录组谱，可以用于准确识别原发性肿瘤部位。血小板转录组同样可以应用于心肌梗塞、狼疮、肾病、肥胖和败血症研究中。转录组分析强调了血小板在血栓激活之外的多种作用，并为未来的研究提供了重要的策略。
显微镜技术可以用于（表2）观察血小板活化以及血栓形成过程中细胞骨架重排过程。血小板粘附试验用于测试血小板粘附和扩散的能力，可以联合使用细胞灌注室和免疫荧光显微镜在静态模式或流动下观察。在细菌激活的先天免疫反应中，具有高放大率的延时相差显微镜已被用于可视化和量化激活后的血小板迁移。活体显微镜等体内成像技术的发展允许实时动态分析血小板和细胞之间的相互作用。超分辨率显微镜和其他纳米技术的出现使纳米分辨率的可视化成为可能，同时克服了光学显微镜的局限性。光刻技术与免疫荧光显微镜相结合已被应用于定量血小板细胞骨架在粘附和扩散过程中产生的机械牵引力。智能图像激活细胞分选 (iLACS) 技术以“智能血小板形态计量学”的形式成功应用于血小板，该技术可能有助于监测抗血小板治疗或识别血栓形成风险增加的患者。
电子显微镜用于研究血小板形态学和超微结构，既是一种基础研究方法，也是一种诊断工具。透射电子显微镜 (TEM)用于研究血小板颗粒释放、血小板微粒的形成和释放以及血小板线粒体功能障碍的分子机制。此外，TEM 也是识别血小板功能缺陷中血小板形态和细胞骨架的关键工具。在临床工作中，推荐使用TEM诊断贮存池病和其他结构异常性疾病，如Hermansky-Pudlak 综合征和 Chediak-Higashi 综合征。与二维的 TEM 相比，传统的扫描电子显微镜 (SEM) 提供三维表面拓扑结构的高分辨率成像，更适用于分析血栓的组成和结构以及活化后血小板的形态变化，但过程繁琐。低温电子显微镜 (cryo-EM) 可用于显示血小板纳米乃至亚纳米分辨率下的血小板扩散和细胞骨架变化。Serial block face SEM和聚焦离子束 SEM可以获得完整血小板的 3D 结构。相关的光学和电子显微镜(CLEM)结合了荧光成像和电子显微镜的优点，用于分析血小板活化过程的超微结构。尽管电子显微镜成像需要专业的技术和昂贵的仪器，但它仍然是研究血小板形态和超微结构的核心技术。
免疫检测的新方法使用特异性抗体和相对便宜的平台就可以识别蛋白质并检测定量差异。酶联免疫吸附试验 (ELISA)常用于测量可溶性血小板活化标志物，包括可溶性P-选择素和血小板因子4 等。血浆血小板活化标志物水平的变化与血栓栓塞事件相关，并为个体化调整治疗方案提供了有价值的信息。然而，ELISA 并不能提供异构体特异性信息。相比之下，蛋白质免疫印迹长期以来一直被用作区分血小板中特定蛋白质表达以及研究细胞内信号通路和表面标志物的经典工具。尽管是半定量的，但蛋白质免疫印迹被认为是最常见和最可靠的技术之一。
血小板疾病的传统临床实验室检测一般依靠血小板计数和血小板功能检测。使用电阻抗的多电极聚集度测定法的发展提供了全血中的血小板功能分析，可用于诊断肝素诱导的血小板减少症，并可作为样本量非常低的儿科患者样本的即时检测（表3）。多电极聚集测量法对检测异常血小板功能的敏感性较低，并且预测预后价值低于LTA，但样品体积要求更低，执行速度更快。尽管血小板聚集反应是评估血小板疾病的最常用方法之一，但这些方法受其敏感性、劳动强度和评估参数数量的限制。
血栓弹力图模拟了生理性全血止血的过程，使用全血来分析血凝块的动态变化，评估血小板、纤维蛋白原和凝血酶的功能。该方法主要用于评估凝血障碍与出血情况，指导大手术（如体外循环和肝移植）的靶向输血治疗。在标准 TEG基础上添加血小板激动剂提供了一种新的检测方法，称为TEG 血小板图谱。使用一次性多通道微流控盒的TEG6s 血小板图谱分析在评估血小板功能方面具有临床实用性，可用于评估 COVID-19 患者抗血小板和抗凝治疗的有效性。
血管血栓形成是一个动态过程，取决于生理血流和血液粘度产生的剪切力，这些剪切力驱动血小板粘附、活化和聚集。最简单、使用最广泛的是血小板功能分析仪（PFA，PFA-100 和 PFA-200），模拟初级止血的流动和高剪切条件下的血小板粘附和聚集，使用柠檬酸全血测量涂有激动剂的膜孔的闭合时间，主要用作筛查血管性血友病和监测抗血小板治疗效果。微流控装置更好地模拟脉管系统，在监测 CAD 患者的抗血小板治疗和预测接受经皮冠状动脉介入治疗的患者的围手术期出血方面显示出潜力。尽管这些新技术补充了血小板功能实验技术的不足，但大多数尚未在临床环境中进行严格测试。
使用严格优化的血小板制备和分离方法以及血小板功能测试，对于在所有血小板研究中获得可重复和临床相关的结果至关重要。将基础研究方法与临床效用分析相结合，使血小板生物学家和临床医生能够全面推进对血小板在心血管和其他疾病中的病理生理作用的理解。此外，这些不同方法的联合使用也为研究抗血小板药物的作用及其作用机制提供了一种手段。
研究显示COVID 19 可导致内皮细胞损伤、凝血障碍和血小板减少症、血栓形成和出血。血小板减少症的机制包括血小板活化和/或消耗，网状内皮系统的清除，以及炎症或直接病毒感染引起的骨髓或巨核细胞抑制。流式细胞术、共聚焦显微镜、TEM 和RNA 测序的结果表明，在COVID-19 住院患者中，血小板-中性粒细胞、血小板-单核细胞聚集体的形成增加，血小板活化增强以及多个基因的表达改变。Althaus使用流式细胞术和蛋白质印迹法研究了患者血清中循环免疫复合物介导的 COVID-19 相关血小板凋亡。质谱流式细胞术也用于揭示独特的血小板过度活化表型。最新的血小板成像技术在 COVID 19 中的一项应用是通过智能血小板形态测量法进行大规模单细胞血小板成像。此外，转录组分析揭示了血小板凋亡和坏死性凋亡的存在。这些基础科学的血小板新兴检测技术在临床应用中具有潜在效用。TEG，尤其是 TEG6 等技术已被证明可用于研究血栓形成标志物的水平以及评估 COVID-19 患者对抗凝剂和阿司匹林的药效学反应。因此，使用传统测定法和尖端技术研究正常生理和疾病中的血小板，并将这些测定法纳入临床决策是有必要的。
血小板已被证明与血栓形成以外的病理生理过程有关，在体内平衡过程中，如免疫调节和血管重塑中显示出关键的额外作用。血小板本身可以具有多种功能状态，并可以与其他细胞（包括免疫细胞和血管平滑肌细胞）进行沟通和调节，以实现这种多样的功能。尽管传统的血小板功能检测方法信息丰富且可靠，但它们在揭示血小板表型异质性和相互作用方面的能力有限。电子显微镜、流式细胞术、质谱和“组学”研究等方法的发展带来了新的见解。在这篇综述中，作者介绍了血小板生物学和功能方面的进展，重点介绍了当前和有前景的方法，还讨论了血小板研究中的技术和生物学挑战。以2019年冠状病毒病（COVID-19）为例，我们进一步描述了这些方法的翻译相关性，以及在患者诊断和护理中可能的“从试验台到床边”效用。
随着基础科学研究取得重大进展，血小板不再被认为是同质体，而是具有不同亚群的异质体，可以预防或促进疾病过程。本综述中总结的经典和先进的技术增强了我们对血小板异质性、不同血小板亚群的功能以及血小板在疾病中作用的机制复杂性的理解（表 4）。在单细胞、单一疾病和单人水平上分析血小板仍是研究的前沿。通过新兴的检测方法有效和准确地研究血小板功能和反应的个体水平差异可能是提高抗血小板药物临床安全性的关键步骤。一些技术也可用于临床的高通量筛查，特别是创伤患者的快速决策以及确定针对独特血小板群体的新疗法。这些技术也能够适用于监测治疗效果，这将提高我们了解疾病病因和出血风险的能力，定制有针对性的疗法用于治疗和预防心血管疾病和其他疾病。
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